产品描述

Afatinib (BIBW2992) Dimaleate 不可逆地抑制 EGFR/HER2，包括 EGFR(wt)，EGFR(L858R)，EGFR(L858R/T790M) 和 HER2，IC50 分别为0.5 nM，0.4 nM，10 nM 和 14 nM；活性比对Gefitinib抵抗型L858R-T790M EGFR突变体高100倍。

靶点（IC50 & Targe）

EGFR (L858R),0.4nM

EGFR (L858R/T790M),10nM

EGFR (wt),0.5nM

HER2,14nM

体外研究

在表达野生型(H1666)或L858R/T790M (NCI-H1975) EGFR的肺癌细胞系中，Afatinib比erlotinib、gefitinib和lapatinib能够更有效的抑制细胞生长。Afatinib同样对表达HER2 776insV (NCI-H1781) 或EGFR E746_A750del (HCC827)的NSCLC细胞系有效，但对表达野生型EGFR 和HER2的A549细胞无效。[1] Afatinib可增强topotecan和mitoxantrone对SP细胞的细胞毒性，并增强topotecan和mitoxantrone对SP细胞的诱导凋亡作用。[1]

体内研究

在MDA-MB-453移植瘤模型中，Afatinib（20 mg/kg，口服给药）可显著诱导肿瘤衰退，累积治疗/对照肿瘤体积比（T/C比）为2%，并下调EGFR和AKT磷酸化水平。[1] 在A7、A431、FaDu、UT-SCC-14和UT-SCC-15移植瘤模型中，Afatinib（30 mg/kg，口服给药）可显著延长肿瘤生长时间。[3] 在HER2扩增移植瘤模型中，Afatinib（30 mg/kg，口服给药）可显著抑制肿瘤生长，并显著延长生存期。[4] 在HER2阳性胃癌NCI-N87移植瘤模型中，Afatinib（25 mg/kg）口服给药4天可显著减小肿瘤体积，给药21天几乎完全治愈肿瘤。[5]

激酶实验

体外激酶实验:

EGFR激酶：每100 μL酶反应体系含10 μl 溶于50% Me2SO的抑制剂，20 μL底物溶液（200Mm HEPES pH 7.4，50 mM乙酸镁，2.5 mg/mL聚（EY），5μg/mlbio-pEY）和20 μL酶。加入50μl 100 μM ATP（溶于10 mM MgCl2）开始酶促反应，室温下反应30分钟，加入50 μl终止液终止反应（250 mM EDTA溶于20 mM pH 7.4 HEPES）。吸取100 μL到链霉亲和素包被微孔中，室温温育60 min后，用200 μL/孔洗涤液（50 mM Tris，0.05% 吐温20）洗涤。每孔加入100 μL 250 ng/mL HRPO标记的anti-PY抗体（Py20H Anti-Ptyr:HRP）。反应60 min后，用200 μL洗涤液洗涤三次。加入100 μL TMB过氧化物酶溶液（A:B= 1:1）。反应10分钟后终止反应，ELISA检测器测定OD450 nm处吸光值。HER2-IC 酶：酶活性在50%Me2SO中，不同浓度的抑制剂存在或不存在下测定。每100μL酶反应体系和EGFR激酶检测体系类似，再加入1000 μM Na3VO4。在10mM醋酸镁中加入50 μL 500 μM ATP溶液开始酶促反应。酶需经过稀释，以含130 mM NaCl、0.05% Triton X-100、1 mM DTT和10% 甘油的20 mM pH 7.4 的HEPES稀释。室温反应30 min，加入50 μL终止液终止。Src激酶的测定：每100μL反应包含10 μL 含抑制剂的50% Me2SO，20 μL酶，20 μL 以1000 μM Na3VO4配置的底物。加入50 μL 1000 μM ATP溶液开始酶促反应。BIRK激酶测定：250 mM pH 7.4 Tris-HCl、10 mM DTT、2.5 mg/mL poly(EY)、5 mg/mL bio-pEY作为底物溶剂，加入由8 mM MnCl2和20 mM 醋酸镁配置的2 mM ATP开始酶促反应。VEGF2和HGFR 激酶实验：室温反应20 min，加入10 μL 5%磷酸终止。用96孔过滤收集板收集沉淀到GF/B过滤器中，经洗涤后，50℃干燥1 h，密封和结合放射性由闪烁计数用TopCount™或Microbeta b counter™检测放射性强度。

细胞实验

Cell lines: SP和NSP细胞系

Concentrations: 1 μM

Incubation Time: 48 h

Method: 采用MTT法测定细胞毒性。IC50值为导致50%细胞死亡的药物浓度。用Bliss法拟合剂量应答曲线和计算IC50值。

(Only for Reference)

动物实验

Animal Models: 负荷ARK2移植瘤的SCID小鼠

Formulation: DMSO

Dosages: 25 mg/kg

Administration: 口服给药

(Only for Reference)

参考文献

[1] D Li, et al. Oncogene. 2008, 27(34):4702-4711.

[2] Wang XK, et al. Cancer Res. 2014, 74(16):4431-4445.

[3] Gurtner K, et al. Radiat Oncol. 2014, 9:261.

[4] Schwab CL, et al. Br J Cancer. 2014, 111(9):1750-1756.

[5] Janjiqian YY, et al. J Nucl Med. 2013, 54(6):936-943.