产品描述

Dacomitinib (PF299804, PF299)是一种有效的，不可逆的泛ErbB抑制剂，最有效作用于EGFR，无细胞试验中IC50为6 nM，高效作用于携带EGFR或ERBB2突变型(耐Gefitinib)和携带EGFR T790M突变型的NSCLCs。Phase 2。

靶点（IC50 & Targe）

EGFR,6.0nM

HER2/ErbB2,73.7nM

体外研究

PF299804是ERBB家族激酶的特异性抑制剂。PF299804抑制EGFR信号传导，并诱导包含EGFR T790M的H3255 GR细胞系凋亡。PF299804能够有效作用于对gefitinib-敏感的和耐药的NSCLC细胞系。PF299804抑制表达T790M 突变体的H3255和 HCC827细胞的生长。T790M 突变体存在下，PF299804抑制EGFR磷酸化。[1]通过在ATP位点的结合，以及ERBB家族成员的催化域中亲核性半胱氨酸残基的共价修饰，PF-299804能够不可逆抑制ERBB酪氨酸激酶活性。[2] PF299804在HER2-扩增的胃癌细胞 (SNU216, N87) 中表现出显著的生长抑制作用，并且与其他EGFR酪氨酸激酶抑制剂，包括gefitinib，lapatinib，BIBW-2992，和CI-1033相比，PF299804具有低50%的抑制浓度值。在HER2-扩增的胃癌细胞，PF299804诱导细胞凋亡和G1期阻滞，并抑制HER家族和下游信号通路，包括STAT3，AKT，和细胞外信号调节激酶(ERK)中受体磷酸化。PF299804也会阻断SNU216细胞中EGFR/HER2，HER2/HER3，和HER3/HER4异质二聚体形成，以及HER3与p85α的结合。[3]一项最近的研究使用47种人乳腺癌和永生的乳腺上皮细胞系，以评估PF299804的抑制作用，结果表明，相对于非扩增细胞系(RR = 3.39, p < 0.0001)，PF299804优先抑制HER-2-扩增的乳腺癌细胞系的生长。在大多数敏感细胞系中，PF299804降低HER2，EGFR，HER4，AKT和ERK的磷酸化作用。PF299804通过G0/G1期阻滞，并诱导细胞凋亡发挥其抗增殖作用

体内研究

PF299804口服给药有效抑制HCC827 Del/T790M异种移植物的生长。[1] PF-299804 (15mg/kg)低剂量口服给药引起显著的抗肿瘤活性，包括在各种人肿瘤异种移植模型中引起显著的肿瘤退化，如表达和/或过表达ERBB家族成员，或与耐gefitinib和erlotinib相关的含有双重突变(L858R/T790M)的ERBB1 (EGFR)异种移植模型。[2]

激酶实验

基于ELISA的 ERBB 激酶试验:

ERBB1，ERBB 2，和ERBB4细胞质融合蛋白通过使用PCR将ERBB1序列(Met-668 到Ala-1211)，ERBB2 (Ile-675到Val-1256)，和ERBB4 序列(Gly-259)复制到杆状病毒载体制备。蛋白质在杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞中以GST融合蛋白表达。蛋白质使用谷胱甘肽琼脂糖磁珠通过亲和色谱法纯化。ERBB酪氨酸激酶活性的抑制使用基于ELISA受体的酪氨酸激酶试验评估。激酶反应(每50 μL 反应混合物包含50 mM HEPES，pH 7.4，125 mM NaCl，10 mM MgCl2，100 μM原矾酸钠，2 mM 二硫苏糖醇，20 μM ATP，PF299804或载体对照，和1-5 nM GST-erbB)在0.25 mg/mL poly-Glu-Tyr包被的96孔板上进行。反应在室温下摇晃培育6分钟。除去反应混合物停止反应，然后用洗涤缓冲液(0.1% Tween 20的PBS溶液)清洗孔。耦合到辣根过氧化物酶(HRP)的0.2 μg/mL抗磷酸酪氨酸抗体(致癌基因Ab-4; 50 μL/well)，在包含3% BSA 和0.05% Tween 20的PBS中稀释，将其加入后，在室温下摇晃25分钟，以检测磷酸化的酪氨酸残基。将抗体移除，板在洗涤缓冲液中清洗。将HRP底物(SureBlue3,3¢,5,5¢-四甲基联苯胺或TMB)加入(50 μL/孔)，并在室温下摇晃培育10-20分钟。TMB反应通过加入50 μL停止溶液(0.09 N H2SO4)停止。信号通过测量450 nm下的吸光度定量。使用中值效应法测定PF299804的IC50值。

细胞实验

Cell lines: 各种 NSCLC 细胞系

Concentrations: 0-20 nM

Incubation Time: 72小时

Method: 生长和生长抑制通过5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑(MTS)法测定。该试验中，比色法测定活细胞数量是基于细胞对MTS的生物还原，以形成可溶于细胞培养基的甲臜产物，通过分光光度法检测。将细胞暴露处理72小时，每个实验使用的细胞数量根据经验测定。所有实验点在6到12个孔中建立，并且所有实验至少重复3次。这些数据使用GraphPad Prism 3.00版的Windows (GraphPad软件)直观显示。曲线使用非线性回归模型通过S形剂量反应曲线拟合。

(Only for Reference)

动物实验

Animal Models: HCC827-GFP 或 HCC827-Del/T790M 肺癌细胞(在0.2 mL PBS中)皮下移植到裸鼠右下方四分之一侧腹。

Formulation: PF299804以10 mM在-20℃ 下溶解于DMSO

Dosages: 10 mg/kg

Administration: 口服强饲给药

(Only for Reference)

参考文献

[1] Engelman JA, et al, Cancer Res, 2007, 67(24), 11924-11932.

[2] Gonzales AJ, et al, Mol Cancer Ther, 2008, 7(7), 1880-1889.

[3] Nam HJ, et al, Mol Cancer Ther, 2012, 11(2), 439-451.

[4] Kalous O, et al, Mol Cancer Ther, 2012, Jul 3.