色谱方法开发的主要挑战是实验条件选择，确保在合理运行时间内提供足够的色谱分辨率。

使用反相色谱柱时，为增加离子和极性分析物的保留时间，选择与分析物相反电荷且带有恰当疏水尾部的离子对试剂（IPR）非常重要。 虽然较长的烷基链能够被固定相更好地保留，但相互作用太强（碳链 >12C时）可能导致不合理的运行时间和色谱柱平衡时间过长。

如何选择合适的离子对试剂？

• 选择一种色谱柱，例如常用的十八烷基硅胶色谱柱 （ODS）；
• 如果存在离子和非离子化合物的混合物，首先分离非离子化合物；
• 可选择性结合目标分析物的IPR；
• 挑选可实现最佳分离的烷基链长度（通过排除法）；
• 从IPR的最低有效流动相浓度开始（理想情况下为0.005 M），且以小增量增加IPR从而提高保留性质并优化分离；
• 注意，不应使用高浓度（极）疏水IPR。
  
  

流动相组成及pH值选择

仅使用HPLC级水和色谱级试剂（有机改性剂）从固定相中提取分析物。洗脱液强度和分析物在流动相中的溶解度之间存在一种平衡，且较高浓度的有机改性剂和极性（乙腈 > 甲醇 > 四氢呋喃）会影响这一平衡。

流动相pH对于调节分析物的离子化程度极为重要。为确保碱性分析物保持带正电荷，pH值应至少低于其pKa两个单位；对于酸性分析物，pH值应至少高于其pKa两个单位。调节流动相pH常用水溶性缓冲液，例如磷酸盐、乙酸盐或甲酸盐。

• 选择可产生最佳分离效果的流动相组成和浓度；
• 以较小增量调整流动相pH从而最大程度提高色谱分辨率；
• 扫描流动相的浊度或晶体形成，因为这些会干扰分析样品；
• 微调洗脱方式（等梯度 vs 梯度）直至达到最佳分离效果。
  
  

色谱柱的清洗与存放

用有机溶剂（如乙腈）冲洗色谱柱，尽量将固定相中的IPR除去，从而防止结块。最好将色谱柱专用于特定的离子对（例如强疏水IPR）以防止混合使用出现测量重现性问题。

其他提示

• 通常选择与固定相弱相互作用的IPR进行梯度运行，从而洗脱液浓度更易调节其固定相浓度。此外，在梯度运行期间，IPR浓度应保持不变。
• 可以考虑使用多孔石墨化碳（PGC）固定相优化分离，其pH（1 – 13范围内）稳定，且具有高密度。
• 温度可能会影响分析物的保留、效率和选择性，所以也应注意监控。
  
  

参考文献

1. Dickman, M. J. Ion Pair Reverse-Phase Chromatography: A Versatile Platform for the Analysis of RNA. Chromatography Today 2011. 22 – 26.
2. Mahrouse, M. A., Lamie, N. T. Experimental design methodology for optimization and robustness determination in ion pair RP-HPLC method development: Application for the simultaneous determination of metformin hydrochloride, alogliptin benzoate and repaglinide in tablets. Microchemical Journal 2019, 147, 691-706.
3. Erich, S., Anzmann, T., Fischer, L. Quantification of lactose using ion-pair RP-HPLC during enzymatic lactose hydrolysis of skim milk. Food Chemistry 2012,135(4), 2393-2396.
4. Soleimani, M., Yamini, Y., Rad, F. M. A simple and high resolution ion-pair HPLC method for separation and simultaneous determination of nitrate and thiocyanate in different water samples. J. of Chromatographic Science 2012, 50(9), 826-830.
5. Pereira, L. Porous Graphitic Carbon as a Stationary Phase in HPLC: Theory and Applications. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies 2008, 31(11-12), 1687-1731.
   
   

相关产品

相关阅读

离子对试剂（IPR）