产品描述

Crizotinib (PF-02341066) 克唑替尼是一种有效的c-Met和ALK抑制剂，在细胞试验中IC50分别为11 nM 和 24 nM。它同时也是有效的ROS1抑制剂，其Ki值小于0.025 nM。

靶点（IC50 & Targe）

ALK,24 nM (cell free)

c-Met,11 nM (A498 cells)

体外研究

PF-2341066作用于mIMCD3小鼠和MDCK犬上皮细胞，作用于c-Met磷酸化作用时具有相似效果，IC50分别为5 nM 和20 nM。PF-2341066作用于表达c-Met ATP-结合位点突变型V1092I 或H1094R或 P-环突变 M1250T 的NIH3T3 细胞，具有相似的活性，且活力增高，IC50分别为19 nM,2 nM 和15 nM,而作用于表达野生型受体的NIH3T3 细胞时，IC50为13 nM。[1] 相反, 观察到PF-2341066作用于表达c-Met活化环突变型Y1230C 和Y1235D的细胞时，与作用于野生型受体相比，效果发生显著改变，IC50分别为127 nM 和92 nM。PF-2341066 作用于分别表达内源性c-Met 突变体R988C和 T1010I 的NCI-H69 和HOP92 细胞，也有效抑制c-Met 磷酸化, IC50分别为13 nM 和16 nM。与作用于c-Met相比，PF-2341066作用于VEGFR2 和PDGFRβ RTKs, 选择性高1000多倍，作用于IRK和Lck选择性高250多倍，作用于Tie2, TrkA,和TrkB选择性高40到60倍。PF-2341066 作用于RON和 Axl RTKs时选择性为20到30倍。相反，PF-2341066 作用于表达ALK RTK 的核磷蛋白 (NPM)- 间变性淋巴瘤激酶(ALK) 致癌融合突变体和 KARPAS299人间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)细胞系时具有相近的IC50值，为24 nM。PF-2341066抑制c-Met依赖的癌细胞的肿瘤表现型，和内皮细胞的血管生成表现型。PF-2341066抑制人GTL-16胃癌细胞生长，IC50为9.7 nM。PF-2341066诱导 GTL-16细胞凋亡，IC50 为8.4 nM。PF-2341066 抑制HGF刺激的人NCI-H441肺癌细胞迁移和入侵，IC50分别为11 nM 和6.1 nM。PF-2341066抑制 MDCK细胞散射，IC50为16 nM。PF-2341066 抑制HGF-刺激的c-Met磷酸化,细胞存活，和Matrigel入侵，IC50分别为11 nM, 14 nM和35 nM。此外, PF-2341066抑制纤维蛋白胶中的血清刺激的 HMVEC分支小管形成 (形成血管)。[1] PF-2341066 作用于Karpas299 或SU-DHL-1 ALCL细胞，也有效抑制 NPM-ALK磷酸化，IC50 为24 nM。PF-2341066 有效抑制细胞增殖，伴随着使细胞周期停在G(1)-S期，且诱导 ALK阳性的 ALCL 细胞凋亡，IC50为30 nM, 但是作用于ALK阴性的淋巴瘤细胞则无效果。 [2] 此外, PF-2341066 抑制骨肉瘤的一些活动行为，及其肿瘤生长 (例如,增殖和存活)和转移 (例如，入侵和形成克隆)。[3]

体内研究

PF-2341066每天按50 mg/kg和75 mg/kg剂量处理GTL-16 模型, 引起大肿瘤 (体积大于600 mm3) 明显衰退，且按43天处理日程处理后，平均肿瘤体积降低60%。在另一项研究中, PF-2341066处理3个月以上，完全抑制GTL-16肿瘤生长，PF-2341066每天按50 mg/kg剂量处理小鼠，3个月后，只有1/12小鼠的肿瘤生长得到提高。PF-2341066每天按50 mg/kg剂量处理NCI-H441 NSCLC 模型处理周期为38天，观察到平均肿瘤体积降低43%。PF-2341066 每天按50 mg/kg剂量作用于 Caki-1 RCC模型，处理周期为33天，观察到平均肿瘤体积降低53%，且每种肿瘤体积降低至少30%。PF-2341066每天按 50 mg/kg剂量作用于 U87MG 恶性胶质瘤或PC-3前列腺癌移植瘤模型,几乎完全抑制肿瘤生长，在实验最后一天，抑制分别达97% 或84%。相反, PF-2341066每天按50 mg/kg剂量口服给药处理 MDA-MB-231 乳腺癌模型,或 DLD-1 结肠癌模型，不会显著抑制肿瘤生长。PF-2341066每天按12.5 mg/kg, 25 mg/kg, 和50 mg/kg剂量作用于 GTL-16 肿瘤，观察到CD31阳性内皮细胞显著降低，这种作用存在剂量依赖性，说明 MVD 受抑制，且具有相关的抗癌高效性，这种作用也存在剂量依赖性。PF-2341066 作用于GTL-16 和 U87MG 模型，显著降低人VEGFA 和IL-8血浆水平，这种作用存在剂量依赖性。PF-2341066口服处理GTL-16 肿瘤，观察到磷酸化的c-Met, Akt, Erk, PLCλ1,和 STAT5水平显著受抑制。[1]PF-2341066 每天按100 mg/kg剂量口服处理携带Karpas299 ALCL 移植瘤的SCID Beige 小鼠，具有抗癌高效性，这种作用存在剂量依赖性，处理15天，所有肿瘤完全衰退。此外, PF-2341066抑制关键NPM-ALK信号调节器, 包括磷脂酶C-γ, 信号转导器，及转录因子3, 细胞外信号调节激酶, 和Akt的激活剂，这些与 NPM-ALK 磷酸化和功能受抑制相关。[2] PF-2341066 抑制骨肉瘤的一些活动行为，及其肿瘤生长(例如, 增殖和存活)和转移 (例如，入侵和形成克隆)。PF-2341066口服饲喂裸鼠，抑制生长和相关的骨肉瘤裸鼠移植瘤的骨基质的形成。[3] PF-2341066 按50 mg/kg 剂量处理 c-MET-扩增的GTL-16移植瘤，引起肿瘤衰退，这与18F-FDG 摄取的缓慢降低相关，且降低葡糖糖转运蛋白 1, GLUT-1的表达。[4]

激酶实验

生化激酶实验:使用连续耦合的分光光度测定c-Met催化活性，通过分析NADH消耗率而测定c-Met诱导的ADP产量，这种作用具有时间依赖性。在 340 nm处使用分光光度法在指定时间点测定吸光值的降低而计算NADH的消耗量。为了测定Ki值, 在含实验试剂的实验孔中加入不同浓度PF-2341066，然后在37oC下温育10分钟。加入c-Met酶开始进行实验反应。

细胞实验

Cell lines: GTL-16胃癌细胞和T47D乳腺癌细胞

Concentrations: 0 nM-256 nM

Incubation Time: 1小时

Method:GTL-16胃癌细胞和T47D乳腺癌细胞接种在96孔板上，孔中含培养基，培养基中含10% 胎牛血清(FBS)，然后转移到无血清培养基中含0.04%牛血清蛋白(BSA)，处理 24小时。 在调查配体依赖的RTK 磷酸化实验中，加入相应的生长因子，处理20分钟。细胞和 PF-2341066和/或适当配体在指定时间温育1小时，然后使用含 1 mmol/L Na3VO4的HBSS冲洗细胞一次,然后从细胞中获得蛋白裂解物。随后,通过夹心酶联免疫吸附试验法使用特定的捕获抗体在96孔板上测定选定蛋白激酶的磷酸化，使用特点检测抗体测定磷酸化的酪氨酸残基。抗体包被的实验板(a) 在蛋白裂解物存在时，在4oC下过夜;(b)在溶于PBS的1% Tween-20 中冲洗7次;(c)在辣根过氧化物酶标记的抗总磷酸（PY-20）抗体（1:500）中温育20分钟;(d) 再次冲洗7次;(e)在3,3′,5,5′-四甲基联苯胺过氧化物酶底物中温育，开始显示反应，加入0.09 N H2SO4终止反应; (f)在450 nm 处使用分光光度计测定吸光度。

(Only for Reference)

动物实验

Animal Models: 携带NCI-H441,或DLD-1,或MDA-MB-231的雌性和雄性nu/nu小鼠

Formulation: --

Dosages: 12.5 mg/kg/day, 25 mg/kg/day, 和50 mg/kg/day

Administration: 口服处理

(Only for Reference)

参考文献

参考文献

[1] Zou HY, et al. Cancer Res. 2007, 67(9), 4408-4417.

[2] Christensen JG, et al. Mol Cancer Ther. 2007, 6(12 Pt 1), 3314-3322.

[3] Sampson ER, et al. J Bone Miner Res. 2011, 26(6), 1283-1294.

[4] Cullinane C, et al. J Nucl Med. 2011, 52(8), 1261-1267.

[5] Gong HC, et al. Int J Proteomics. 2011, 2011, 215496.

[6] Zou HY, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015, 112(11):3493-8