β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)一般是指能将β-半乳糖苷水解为半乳糖和糖苷的酶,早先被作为大肠杆菌诱导酶的典型。在生物研究中,常用与此酶对应的底物来检测酶的活性,从而可轻易地检测出结构基因的表达。
X–Gal是β-半乳糖苷酶的显色底物,水解后呈蓝色。基于这个特点,pUC系列载体DNA(或其他带有lacZ基因载体的DNA)以LacZ缺失细胞为宿主进行转化时,或用M13噬菌体载体DNA进行转染时,如果在平板培养基中加入X–Gal和IPTG,由于β–半乳糖苷酶的α–互补性,即可以根据是否呈现白色菌落(或噬菌斑)而很方便地挑选出基因重组体。具体反应如下图所示:
首先把X-Gal配制成20mg/ml的二甲基甲酰胺(DMF)溶液(-20℃避光保存),然后在100ml的琼脂培养基中,加入200μl的上述溶液、100μl的IPTG(24mg/ml)和100μl的Amp(100mg/ml),制作成X-Gal、IPTG、Amp平板培养基。当DNA片段插入至pUC系列载体(或其他带有lacZ、Amp基因载体),然后转化至lacZ缺失细胞中后,涂布上述的X–gal、IPTG、Amp平板培养基,可根据长出菌体的蓝白色,而方便地挑选出基因重组体(白色为具有DNA插入片段的基因重组体)。
1. 培养噬菌体时,Top agar中的添加量为:50 μl/3ml(20mg/ml)。
2. 含有X-Gal的培养基应4℃避光保存,且须在1~2周内使用完。