牛奶中黄曲霉毒素M1的测定-百灵威

黄曲霉毒素M1（AFTM1），属于黄曲霉毒素（Aflatoxins）类化合物，是常见黄曲霉菌和寄生曲霉菌的代谢产物，具有致癌性和致突变性，为强致癌剂。AFTM1性质相对稳定，易存在于乳及乳制品中，严重威胁人类健康。

本方案结合国标GB5009.24-2016《食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素M族的测定》第二法-高效液相色谱法，分别对牛奶进行0.25μg/kg和0.50μg/kg两个浓度AFTM1加标验证。AFTM1在0.05ng/mL～5.00ng/mL范围内线性相关系数为0.99995。平均回收率在90.0%～92.5%范围内，相对标准偏差在2.97%～4.86%范围内。方法重复性好、加标回收率高，适用于牛奶中黄曲霉毒素M1的检测。

样品前处理

一、样品提取

称取4g牛奶（精确到0.001g）于50mL离心管中，涡旋混匀后静置30min，加入10mL甲醇，涡旋3min。置于4℃、8000r/min离心10min，取上清液8mL于另一洁净的50mL离心管中，8000r/min离心3min。取6.5mL上清液，加入40mL PBS稀释，混匀，待净化。

二、样品净化（905330黄曲霉毒素M1免疫亲和柱 , 3 ml）

将低温下保存的免疫亲和柱恢复至室温（最适宜的使用温度为25℃左右），免疫亲和柱内的液体流完后，将上述稀释液全部过柱，调节流速为1mL/min~3mL/min。待样液滴完后，加入10mL一级水，以稳定流速淋洗。待水滴完后，抽干亲和柱。
在柱下放置15mL离心管，加入4mL甲醇洗脱亲和柱，流速控制在1mL/min~3mL/min，流干后，抽干亲和柱，收集全部洗脱液。在45℃下氮气缓缓地将洗脱液吹至近干，用初始流动相定容至1.0mL，涡旋30s溶解残留物，过0.22μm尼龙膜，收集滤液于进样瓶中，上机测试。

三、过程空白实验

1、过程空白：取一支洁净的50mL具塞离心管，不称取试样，按照上述步骤一和步骤二进行提取、净化，浓缩，取续滤液上机测试。
2、空白本底实验：称取空白牛奶4g（精确至0.001g）按照上述步骤一和步骤二进行提取、净化，浓缩，取续滤液上机测试。

三、标准系列工作溶液

标准系列工作溶液：分别准确吸取标准工作液（100ng/mL）5μL、10μL、50μL、100μL、200μL、500μL至10mL容量瓶中，用初始流动相定容至刻度，AFTM1的浓度为0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL。

分析检测

一、液相色谱条件

色谱柱：C18-H液相色谱柱（4.6mm×250mm，5µm）
流动相：A：水乙酸铵溶液 B：乙腈-甲醇(50%+50%)
流速：1mL/min
柱温：40℃
进样量：50µL
洗脱方式：等度洗脱，A，70%；B，30%
荧光检测波长：激发波长360nm；发射波长430nm

二、检测结果

表1 线性关系和相关系数

表2 加标回收率及RSD

图1 牛奶中黄曲霉毒素AFTM1检测色谱图

注：A2为加标浓度0.25μg/kg，B3为加标浓度0.50μg/kg

产品列表

品名	分类	货号
Aflatoxin B1, 98%, from Aspergillus flavus 黄曲霉毒素 M1 , 98% , 来源于黄曲霉	标准品	615215
Phosphate buffered saline, 10×, BioUltra, pH7.2-7.4 PBS 缓冲液	试剂	1914020
Methanol, 99.9%, LC-MS 甲醇	试剂	952707
Acetonitrile, 99.9%, LC-MS 乙腈	试剂	932537
黄曲霉毒素M1免疫亲和柱 , 1 ml	耗材	2660424
黄曲霉毒素M1免疫亲和柱 , 3 ml	耗材	905330
黄曲霉毒素总量免疫亲和柱 , 1 ml	耗材	2660425
C18-H 液相色谱柱	耗材	1122769
有机系尼龙66 针式过滤器	耗材	9215892
短螺纹样品瓶 , 2ml, 9mm, 11.6×32mm, 棕色, 广口, 带书写签	耗材	902590
离心管, 50 mL	耗材	966183

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